贝克曼库尔特 · 余启昆：分析型超速离心技术在AAV病毒载体研究和质控中的应用
2024-07-31 16:22:30
余启昆 贝克曼库尔特生命科学市场部的分析型超速离心机应用专家
分析型超速离心机应用专家，负责整个华东区域离心机产品的技术支持与管理，专注于分析型超速离心机应用研究。精通分析型超速离心机（AUC）在AAV病毒载体研究和质控中的应用，熟悉分析型超速离心机的多种应用场景（基因治疗、抗体药物、疫苗、结构生物学等领域），多次参与及开展AUC相关专题会议与培训，具有丰富的AUC理论实操经验！
Q：随着AAV基因疗法的快速发展，现有的AAV分析质控技术已经不能满足AAV药物的质控需求。现阶段AAV的质控技术面临着哪些挑战？
AAV质控涉及的范围比较广比如衣壳蛋白鉴别、效价、纯度等，涉及的技术手段也非常多比如毛细管电泳、ELISA、qPCR、AUC等等。因为我们这边重点关注在AAV空壳率检测这一块，那么就着空壳率检测谈谈看法。对于为什么要进行空壳率检测的原因不言而喻，所以CDE、FDA以及EMA都有相关的指导原则对其进行规范，在指导原则中明确指出需要检测AAV空壳病毒、错误包装病毒、病毒聚集体等杂质的残留。目前市场上声称能检测AAV空壳率的技术非常多，但实际情况不尽如人意。电镜是常用于空壳率检测的参考方法，可直接检测颗粒直径，可以区分empty和full，但是很难区分partial。电镜在定量方面也存在一定问题，需要对大量采集的图片结果进行统计学分析（仅几千个颗粒），从而得到定量结果，相对比较麻烦。CD-MS等质谱方式可以很好地区分empty和full，但是对partial的区分度不好，且低通量，制样非常麻烦。阴离子交换层析(AEC)，通量高，但无法检测partial和聚集体，对empty和full的区分不理想，该方法常在工艺开发中使用。SEC-MALS该方法通量高，作为一种非直接检测方式可以区分empty和full，但无法检测partial和聚集体，稀释了样品，可能导致原有聚集体解聚或者新聚集体生成，另外存在截留、非特异性相互作用等。动态光散射(DLS)作为一种低精度的技术，难以从粒径上区分empty，partial及full，因为这些颗粒粒径差异很小！
分析型超速离心技术(AUC)是目前大家公认的测定空壳率的标准方法，作为一项曾荣获诺奖的经典技术，该方法完全基于数学和物理，测定样品的流体力学性质，基于天然状态的样品，不需要标记物和标准品，非破坏性，样品可回收。此外，该方法直接给出AAV各成分百分比（empty，partial，full，aggregate及载体碎片等）和粒径值。若不考虑设备折旧，该方法单次实验成本低，仅红色垫片为一次性使用的耗材，其他的耗材皆可以重复使用。
Q：超速离心法是AAV制备最主要的工艺，但超速离心法对于AAV载体实现大规模生产存在一定困难，请您为我们介绍一下有哪些优化措施可以提高AAV载体的分离纯化效率？
对于AAV大规模纯化其中最常用的方法使用离子交换层析或亲和层析方法等。但是针对不同的血清型，需要与之对应的纯化柱，用于填充纯化柱的特定树脂成本非常昂贵。超速离心法的局限性在于单次超速离心可处理的上清液体积相对较小，但是随着大体积溶液浓缩技术的发展，已经使得我们可以用超速离心这种简单易行的方法去做最后一步纯化。前期可使用切向流过滤的方式如中空纤维过滤，对大容量样品进行浓缩，之后再通过碘克沙醇密度梯度离心进行纯化。同时，可对碘克沙醇密度梯度液进行优化：采用3ml 25%、4ml 40% 和2ml 60%的碘克沙醇密度梯度液，改进的方法允许填充30ml体积的病毒悬浮液，是经典方法的上样体积的2倍，此外单次离心时间可以缩短到20min。优化后的碘克沙醇密度离心法与经典的碘克沙醇密度梯度离心法相比，其纯度及病毒衣壳方面没有差异，但处理量得到了极大的提升。
另外，2019年报道，基于杆状病毒系统生产AAV，通过TPP（三相分区法）联合密度梯度离心法进行AAV的纯化，2轮TPP可去除细胞裂解液中高达90%的细胞杂质，然后使用密度梯度离心法去除空壳和剩余的细胞杂质，可从3L细胞培养液中纯化超过3e+15 vg AAV载体（仅需2管离心）。通过这种方式，使用六孔的SW28转头，同时离心6管样品将能够纯化达1e+16vg 的AAV载体，可以为小规模临床试验提供足够的材料（ZOLGENSMA的推荐剂量为重1.1e+ 14 vg/kg）。目前贝克曼新推出的VTi50.1垂直转子，容量高达468mL (12 x 39mL)，可以极大提高单批次纯化的处理量，对于眼科、鞘内等局部给药方式的AAV药物开发，密度梯度离心法可能是一种非常好的选择！
Q：分析型超速离心（AUC）是对AAV多种形态进行分析的公认的标准方法，请您为大家介绍一下该技术的原理。
普通的离心机大家都用过，我们把样品放在离心管里面，然后放到离心机中离心，我们看不到样品在整个离心过程中的实时变化情况。AUC可提供最高60,000rpm （300,000x g）转速，可区分100Da 至1GDa ( 1 e+6kDa)大小的颗粒，其原理简单来讲就是“可视化离心过程”：在AUC中有2种不同的检测器，紫外可见吸收检测器和激光干涉检测器，这2个检测器可以在离心过程中实时扫描，然后以一系列“S”型曲线的形式将整个离心过程记录下来，从而实现了对整个离心过程的可视化。得到“S”型曲线数据集后，可通过Sedfit和UltraScan等软件进行数据分析，可以得到样品沉降系数、纯度、百分比、聚集状态、相对分子量（M）、水合粒径、化学计量比及形状等多方面的信息。
颗粒的大小可以通过沉降系数来定义，沉降系数是生物大分子的特征常数，它除了与颗粒的密度、形状和大小有关以外，还与所处的介质液密度、粘度有关。由于AAVempty，partial，full在形状粒径上差异非常小，但是沉降系数存在较大差异，因此通过AUC技术可以很好对其进行区分及分析。
Q：根据您多年的AUC理论实操经验，除了经典AAV的空壳率外，AUC技术还可以应用在哪些领域？
除了经典AAV的空壳率外，AUC可广泛应用于如抗体药物、ADC药物、脂质体纳米颗粒、溶瘤病毒及结构生物学（科研）等诸多领域。具体情况如下：
一、抗体药物：1、AUC是FDA推荐的抗体药物表征方法；2、可用于抗体的聚集体检测，可精确测定单体及聚集体（单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体及其他高聚体等）的百分比含量；3、也可用于检测靶点与抗体的结合比例；4、可用于抗体的储存条件、温度、制剂等方面的筛选。5、AUC可用于ADC药物的表征，表征ADC药物的单抗聚集体，检测单抗和偶联药物的DAR值。
安进公司的阿达木单抗以及复宏汉霖曲妥珠单抗(HLX02)皆用了AUC方法进行表征！
二、脂质体纳米颗粒：1、AUC是纳米颗粒表征利器；2、该方法遵循第一性原理(基于数学、物理），不需要标准品、非破坏性，样品可以回收；3、针对纳米颗粒（包括脂质体、脂质纳米颗粒、聚合纳米颗粒、树状聚合物等），AUC可根据载药颗粒及游离药物的沉降系数不同对包封率进行准确分析（小分子药物,siRNA,miRNA等），也可用于检测游离聚合物的含量！4、AUC可对纳米颗粒粒径及分子量进行准确分析；5、可测定纳米颗粒的偏微分比容/密度，从而研究不同纳米颗粒的核酸载量(siRNA，mRNA等)，有效区分empty及full纳米颗粒，检测纳米颗粒的纯度信息。6、研究纳米载药颗粒的储存条件（时间、温度）、降解原理等，可广泛应用于基因治疗（非病毒载体）、mRNA疫苗、核酸药物等领域！
此外，CDE发布的新冠预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则中提到了要对截短RNA、长链RNA、双链RNA(dsRNA)等进行检测。据我所知，目前大家正在用多种方法进行正交检测，相对来说是比较麻烦的。AUC作为一种高精度的表征方式，最小可以区分具有5%分子量差异的生物大分子，我们认为AUC可以一次性表征包括截短RNA、单体RNA分子（目标分子）、长链RNA、双链RNA及RNA聚集体等多种成分，部分数据正在测试之中，相信不久就能和大家见面！
总的来讲，AUC的强大之处在于：通过单一的实验可快速并完整地表征异质性纳米颗粒中每种独特粒子组分的大小、密度（组成指标）和分子量等，纳米脂质体研究表征缺的就是这样的一个综合性平台！
三、溶瘤病毒领域：CDE近期发布的溶瘤病毒产品征求意见稿及ICH制定的《基因治疗产品非临床生物分布考虑》指导原则中明确指出产品相关的杂质包括分子变异体、非完整包装病毒(非包膜病毒、空壳病毒)、病毒颗粒集聚体等，对于这些成分需要鉴定分析、评估其安全性。目前溶瘤病毒领域大家用的比较多的病毒包括疱疹病毒、腺病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、呼肠孤病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒及脊髓灰质炎病毒等。AUC作为病毒空壳率检测公认的标准方法，可利用该方法对上述溶瘤病毒的空壳及聚集体进行检测，目前也已有大量检测的报道！
